RT-PCR試劑盒的兩種檢測(cè)模式介紹
點(diǎn)擊次數(shù)：668 更新時(shí)間：2022-12-01
RT-PCR試劑盒具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速等特點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于農(nóng)獸藥、真菌殘留檢測(cè)，該方法從加樣、洗板、顯色到讀數(shù)步驟繁多，其中任何一步控制不好都可能影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
今天要為大家介紹的是RT-PCR試劑盒的兩種檢測(cè)模式：
1、雙雜交探針模式(FRET)：FRET探針又稱雙雜交探針，F(xiàn)RET探針由兩條相鄰探針組成，在一條探針端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，另一探針端標(biāo)記Red640熒光基團(tuán)。當(dāng)復(fù)性時(shí)，探針結(jié)合在模板上，F(xiàn)AM基團(tuán)和Red640基團(tuán)相鄰，激發(fā)FAM產(chǎn)生的熒光，作為Red640基團(tuán)的激發(fā)光被吸收，使Red640發(fā)出波長(zhǎng)為640的熒光。當(dāng)變性時(shí)，探針游離，兩基團(tuán)距離遠(yuǎn)，不能產(chǎn)生640波長(zhǎng)的熒光。由于FRET探針是靠近發(fā)光，所以檢測(cè)信號(hào)是實(shí)時(shí)信號(hào)，非累積信號(hào)。
2、交探針模式(Beacon)：分子信標(biāo)是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。熒光基團(tuán)被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團(tuán)產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見(jiàn)光形式釋放出來(lái)。分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并與目標(biāo)序列互補(bǔ)；莖一般5-7個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并相互配對(duì)形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)標(biāo)記在探針的一端，而淬滅劑則標(biāo)記在另一端。在復(fù)性溫度下，因?yàn)槟０宀淮嬖跁r(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)加熱變性會(huì)互補(bǔ)配對(duì)的莖環(huán)雙鏈解開(kāi)，如果有模板存在環(huán)序列將與模板配對(duì)。與模板配對(duì)后，分子信標(biāo)將成鏈狀而非發(fā)夾狀，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開(kāi)。當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時(shí)，因淬滅作用被解除，發(fā)出激發(fā)光子。由于是酶切作用的存在，分子信標(biāo)也是積累熒光。
